La carnitine dérivée du microbiome imite en tant que médiateurs auparavant inconnus de la communication de l'axe intestin-cerveau

Résumé

Les altérations du microbiome intestinal sont associées à diverses maladies neurologiques, mais les preuves de la causalité et de l'identité des composés dérivés du microbiome qui interviennent dans l'interaction de l'axe intestin-cerveau restent insaisissables. Ici, nous identifions deux métabolites bactériens jusque-là inconnus, le 3-méthyl-4- (triméthylammonio) butanoate et le 4- (triméthylammonio) pentanoate, analogues structuraux de la carnitine qui sont présents à la fois dans l'intestin et le cerveau d'un pathogène spécifique – souris libres mais absentes dans le germe – souris libres. Nous démontrons que ces composés sont produits par des bactéries commensales anaérobies de la famille des Lachnospiraceae (Clostridiales), colocalisent avec de la carnitine dans la substance blanche du cerveau et inhibent l'oxydation des acides gras induite par la carnitine dans un modèle de culture de cellules murines de matière blanche du système nerveux central. Il s'agit de la première description de l'échange moléculaire inter-règne direct entre les procaryotes intestinaux et les cellules cérébrales de mammifères, conduisant à l'inhibition de la fonction des cellules cérébrales.

INTRODUCTION

Bien que le microbiome puisse exercer une certaine protection contre les agents pathogènes envahissants, des changements substantiels et durables dans sa composition sont liés à de nombreuses maladies qui ont récemment été considérées comme indépendantes de l'influence microbienne. Des travaux récents ont montré que le microbiome est également fondamentalement modifié dans de nombreuses conditions neurologiques, notamment la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson, les troubles du spectre autistique (TSA), la maladie d'Alzheimer et le syndrome de fatigue chronique (1, 2). Bien que peu de preuves concluantes soutiennent un rôle causal du microbiome dans les maladies neurologiques, la communication bidirectionnelle entre le microbiome intestinal et le cerveau est maintenant reconnue comme un médiateur important de la santé neurologique. Des études sur des modèles animaux soulignent l'importance d'un microbiome stable, car sa perturbation, principalement aux stades de développement clés, entraîne des effets à long terme sur l'anxiété, le développement et le comportement (3). En outre, les effets positifs de la supplémentation bactérienne intestinale sur le cerveau sont signalés, tandis que les résultats positifs des interventions thérapeutiques dans certains cas peuvent être attribués au microbiote intestinal (4).

Les microbes stimulent la production de neurotransmetteurs hôtes dans l'intestin et synthétisent leurs propres neurotransmetteurs reconnus par l'hôte (5, 6). Ils peuvent également stimuler le système immunitaire de l'hôte, entraînant une inflammation et des changements notables dans la composition du microbiote intestinal susceptibles d'avoir des effets neurologiques (7). Alors que les molécules d'origine microbienne telles que les acides gras à chaîne courte peuvent pénétrer dans le cerveau pour exercer leurs effets, la plupart des molécules microbiennes qui influencent l'axe microbiome-intestin-cerveau (MGB) médient leurs effets indirectement via l'intestin hautement énervé et le nerf vague (8, 9).

RÉSULTATS

Pour identifier les métabolites microbiens inconnus qui interviennent dans la communication de l'axe MGB, nous utilisons l'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour identifier les molécules qui sont présentes à la fois dans l'intestin et le cerveau de souris C57BL / 6 spécifiques sans pathogène (SPF) mais absentes des germes sans germes (GF) C57BL / 6 souris. Cette approche permet d'identifier des molécules connues et nouvelles, avec une haute résolution spatiale. Nous avons détecté une molécule à un rapport masse / charge (m / z) de 160,133 par désorption / ionisation laser assistée par matrice (MALDI) -MSI et désorption par électropulvérisation ionisation (DESI) -MSI dans l'intestin et le cerveau des souris SPF à des niveaux plus de 20 fois plus élevés que les coupes de tissus correspondantes de souris GF (Fig. 1 et Fig. S1). MALDI-MSI a été utilisé pour obtenir une image à haute résolution latérale pour l'analyse de la région du cerveau, et DESI-MSI a été utilisé pour une analyse plus approfondie à haute résolution spectrale. La détection de la molécule m / z 160,133 chez les souris GF était comparable au contrôle négatif hors tissu de référence (fig. S1). Cette molécule, provisoirement dénommée Met1, était abondante dans la matière blanche du cerveau (moelle, corps calleux et arbor vitae) (figure 1B). Met1 a également été détecté de manière systémique chez des souris C57BL / 6 de type sauvage, dans le sang, le foie, les reins, les poumons, la rate, l'intestin, les testicules et le cœur (fig. S2).

Fig.1. 1 MALDI-MSI sur des coupes cérébrales et intestinales de souris C57BL / 6 GF et SPF.

(Et) Coupes colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (en haut) et images MALDI-MSI (en bas) du tissu cérébral. MALDI-MSI identifié m / z 160,133 qui était absent chez les souris GF mais présent dans des emplacements discrets dans le cerveau des souris SPF. ((B)) Diagramme à barres de l'abondance relative m / z 160,1 dans différentes régions du cerveau SPF et la moyenne sur l'ensemble du cerveau. (C) Ce métabolite était également présent dans le côlon SPF mais absent dans le côlon GF. a.u., unités arbitraires. Régions cérébrales annotées: cervelet; arb; arbor vitae; MO, moelle oblongue; P, pons; MB, mésencéphale; cc, corps calleux; fr, fasciculus retroflexus. La barre d'intensité de la carte thermique montre l'échelle de couleurs des faibles niveaux de molécule (noir / bleu foncé) aux niveaux élevés de molécule (rose / blanc). Barres d'échelle, 1 mm.

Comme la détection de Met1 chez les souris GF était comparable au contrôle négatif, cela suggérait une origine microbienne pour le composé chez les souris SPF. Par conséquent, nous avons déterminé si Met1 dans le côlon pouvait être réduit par un traitement de 7 jours avec un cocktail d'antibiotiques non résorbables. Ce traitement a permis de réduire considérablement les niveaux de Met1 (P ≤ 0,05), soulignant l'origine microbienne probable de Met1 (fig. S3). Nous avons ensuite criblé des souches bactériennes intestinales du microbiote intestinal des souris C57BL / 6 pour la production de Met1. Des souches bactériennes isolées à partir d'excréments murins ont été cultivées sur des plaques de gélose au bouillon anaérobie fastidieux (FAB) avant que les colonies ne soient remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et repérées sur des lames de verre pour le dépistage de Met1 par MSI. Un pic à m / z 160.133 a été détecté dans deux souches bactériennes étroitement apparentées Clostridium XIVa amas de la famille des Lachnospiraceae, déterminé par 16S Le séquençage de l'ADN ribosomal (ADNr) Clostridium clostridioforme et Clostridium symbiosum (Fig.2). Les deux souches sont des commensaux intestinaux humains formant des spores entériques qui sont obligatoirement anaérobies tout en C. clostridioforme est également un pathogène opportuniste (10).

Fig.1. 2 DESI-MSI a été utilisé pour cribler les bactéries intestinales pour la production de métabolites d'intérêt.

Les cultures bactériennes ont été cultivées sur gélose FAB solide et les colonies ont été remises en suspension dans du PBS en OD600 (à 600 nm) d'environ 0,3. Deux microlitres ont été mis à sécher à l'air sur une lame avant MSI. Souches bactériennes testées:Et) C. symbiosum LM19R, ((B)) C. symbiosum LM19B, (C) C. clostridioforme LM41A, (D) C. symbiosum LM42D, (E) Bifidobacterium animalis LM33, (F) Lactobacillus animalis LM31, (G) Propionibacterium spp. YM23, (H) Clostridium difficile LM27, (Je) Enterococcus faecalis YM13, (J) Bacteroides fragilis NCTC 9343 (type souche)K) C. clostridioforme NCTC 11224 (type souche)L) C. clostridioforme NCTC 7155 (type souche)Mcontrôle viergeNcontrôle viergeO) C. symbiosum LM19R et (P) Escherichia coli F18.

D'autres souches clostridiennes testées ici n'ont pas produit cette molécule, et sa production n'a pas été détectée dans tous C. clostridioforme Souches testées, y compris C. clostridioforme souche de type NCTC11224 (figure 2). Pour nous assurer que le métabolite bactérien était Met1, plutôt qu’un isomère structurel, nous avons effectué une analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) du métabolite bactérien à m / z 160.133 à partir de C. clostridioforme et Met1 du cerveau murin. Les spectres d'ions du produit Met1 provenant de différentes sources correspondent, confirmant que les molécules du cerveau murin et C. clostridioforme étaient structurellement identiques (fig. S4). Sur la base des spectres MS / MS acquis, nous pensons que Met1 a une structure similaire à la carnitine, car deux fragments de masse indicatifs pour un groupe triméthylamine ont été observés (m / z 58.066 et m / z 60.081) Le long de la différence de masse du groupe acide carboxylique (la différence entre les ions produits à m / z 101.060 et m / z 55.055). De plus, les spectres MS / MS générés semblaient très similaires à ceux précédemment rapportés pour la bétaïne acide 5-aminovalérique (5-AVAB; également connue sous le nom de N(triméthyl-5-aminovalérate), qui a un effet identique m / z 160.133 (11). Cependant, pendant la fragmentation MS / MS, nous avons noté des différences distinctes dans l'intensité des pics à m / z 60.081 et m / z 55,055 à des énergies de collision plus élevées entre Met1 et un standard 5-AVAB synthétisé, ce qui nous fait douter que Met1 était 5-AVAB (fig. S5). Pour élucider définitivement la structure, nous sommes soumis à une fraction bactérienne contenant Met1 en spectroscopie de corrélation par résonance magnétique nucléaire (RMN) (1H-1H COSY). La RMN a déterminé que Met1 était un mélange de deux isomères structuraux ne différant que par l'emplacement de la chaîne latérale méthyle, située sur le butanoate C3 (3-méthyl-4- (triméthylammonio) butanoate (3M-4-TMAB)) ou C4 (4- (triméthylammonio) pentanoate (4-TMAP)) de la structure (Fig. 3). L'analyse par RMN a également montré que les métabolites étaient produits dans un rapport équimolaire par les bactéries aux côtés de la molécule conjuguée γ-butyrobétaïne (GBB). Détection de GBB aux côtés de 3M-4-TMAB et 4-TMAP C. clostridioforme suggère qu'il peut être le précurseur de ces molécules, ainsi que le précurseur direct de la carnitine. Cependant, contrairement au 3M-4-TMAB et au 4-TMAP, le GBB est synthétisé par une gamme de bactéries intestinales ainsi que des cellules de mammifères, ce qui signifie que le suivi du GBB produit par les producteurs bactériens de 3M-4-TMAB et 4-TMAP n'était pas possible.

Fig.1. 3 1H-1H COSY d'extraits bruts montrant la présence de trois dérivés apparentés du triméthylammonium.

Les pics croisés ont été codés en couleur en conséquence, tandis que les raies montrées sur le spectre représentent la corrélation entre les protons de couplage dans le dérivé respectif: 3M-4-TMAB (vert) et 4-TMAP (rouge) ainsi que le congénère déméthylé, GBB (noir).

Parce que 3M-4-TMAB est très similaire dans sa structure à la carnitine et 4-TMAP est similaire à GBB, le précurseur direct de la carnitine, nous avons utilisé MSI pour étudier la colocalisation de 3M-4-TMAB et 4-TMAP avec la carnitine dans le cerveau de souris SPF tranches. La carnitine est un médiateur majeur de l'oxydation des acides gras (FAO), transportant les acides gras à longue chaîne sous forme d'acylcarnitines à travers la membrane dans les mitochondries où ils sont décomposés. La visualisation de la carnitine a été effectuée à l'aide de MALDI-MSI et DESI-MSI a été utilisée pour obtenir une précision m / z (162.112) pour une identification ultérieure (Fig. 4). Spectres de masse de MALDI-MSI et DESI-MSI m / z 160.1 et m / z 162.1 sont représentés sur la fig. S6. Le traitement des images MSI de 3M-4-TMAB / 4-TMAP et de carnitine a été effectué à l'aide de l'analyse spectrale (12). Le chevauchement des régions à haute intensité m / z 160,1 (3M-4-TMAB et 4-TMAP); m / z 162,1 (carnitine) a été calculée et le coefficient de corrélation de Pearson a été déterminé pour ces molécules sur trois sections de chacune des trois souris SPF. Les résultats indiquent un chevauchement important entre les signaux et la colocalisation spatiale entre 3M-4-TMAB et 4-TMAP et la carnitine dans le cerveau (corrélation de Pearson: SPF1, 0,921547; SPF2, 0,906855; SPF3, 0,609946), ainsi qu'un certain nombre d'autres molécules qui le coefficient de corrélation de serpent et de Pearson supérieur à 0,8 (figure 4). Le coefficient de corrélation de Pearson a également été déterminé pour m / z 160.1 et m / z 162,1 dans le cerveau de souris GF, et la présence de ceux-ci n'a pas été corrélée (corrélation de Pearson: GF1, .120.12976; GF2, .0000.00027; GF3, 0,177441; fig. S6). Cela suggère en outre que le signal à m / z 160.1 détecté dans le cerveau de souris GF pourrait résulter de molécules de masse similaire (comme décrit sur la figure S1B) qui n'ont pas pu être résolues dans la présente étude. Pour garantir que la colocalisation moléculaire chez les souris SPF était une corrélation sous-jacente, par opposition aux changements tissulaires dans la suppression des ions, la normalisation du nombre total d'ions a également été appliquée avant l'analyse. Cela indique que la carnitine m / z 162 est dans le top 3 des molécules hautement corrélées avec 3M-4-TMAB / 4-TMAP (Tableau S1). Par conséquent, en plus d'être structurellement similaires à la carnitine et à son précurseur, 3M-4-TMAB et 4-TMAP ont également été trouvés aux mêmes endroits dans le cerveau.

Fig.1. 4 Conversion de MALDI-MSI en images binaires montrant des régions à haute intensité (noir) et à faible intensité (gris) des images ioniques de m / z 160,1 (3M-4-TMAB / 4-TMAP) m / z 162,1 (carnitine).

Le chevauchement de ces régions a ensuite été calculé comme le pourcentage de pixels dans la région à haute intensité de la région m / z 160,1 image qui étaient également de haute intensité dans le m / z 162.1 image. De plus, le coefficient de corrélation de Pearson entre les deux images a été calculé pour chaque tissu à travers trois répétitions biologiques (SPF1, SPF2 et SPF3), avec un coefficient de 1 indiquant une colocalisation parfaite et indiquant1 indiquant aucune colocalisation (chevauchement SPF1 92.85714, corrélation de Pearson coefficient 0.921547; SPF2 93.20652, 0.906855; SPF3 63.20542, 0.609946).

Suite à la caractérisation structurale des métabolites 3M-4-TMAB et 4-TMAP, les standards de chacun ont été synthétisés et utilisés pour quantifier la concentration endogène dans le cerveau SPF via MSI. Il a été déterminé que 3M-4-TMAB et 4-TMAP étaient présents à des niveaux équimolaires dans des échantillons bactériens par RMN (figure 3); par conséquent, les normes de 3M-4-TMAB et 4-TMAP étaient également mélangées, et une courbe de concentration a été générée en repérant des concentrations définies sur ce cerveau GF avant l'analyse MSI. Il a été utilisé pour déterminer la concentration de métabolites endogènes dans le cerveau SPF. La concentration moyenne dans l'ensemble du cerveau des métabolites a été déterminée comme étant de 0,37 à 0,4 μM. La concentration moyenne à travers le corps calleux et l'hippocampe était plus élevée, environ 13 à 17,1 μM, indiquant une accumulation notable de 3M-4-TMAB / 4-TMAP dans ces zones (Fig. 5 et Fig. S7).

Fig.1. 5 La quantification de 3M-4-TMAB et 4-TMAP dans le cerveau de souris a été effectuée en utilisant DESI-MSI de m / z 160.133.

(Et) Un mélange équimolaire d'étalons 3M-4-TMAB et 4-TMAP a été préparé et repéré sur la section cérébrale GF à diverses concentrations. ((B)) Le m / z 160,133 intensité ionique de chaque spot à partir des résultats MSI a été utilisée pour générer une courbe de concentration par rapport à la quantité de standard dans chaque spot. (C) La courbe de concentration a été utilisée pour calculer la concentration endogène moyenne de 3M-4-TMAB et 4-TMAP dans l'ensemble du cerveau et dans la zone de forte abondance, le corps calleux et la région de l'hippocampe. La région très abondante est décrite en (A). Les résultats montrent deux répétitions techniques pour les coupes cérébrales GF et SPF.

Compte tenu du niveau de similitude structurelle et de colocalisation spatiale qui a été observé entre la bactérie 3M-4-TMAB et la 4-TMAP et la carnitine hôte, nous avons émis l'hypothèse que ces molécules bactériennes pouvaient inhiber la fonction de la carnitine dans les cellules hôtes. À l'aide de 3M-4-TMAB et 4-TMAP synthétiques, nous avons testé leur capacité à inhiber la fonction mitochondriale en présence de carnitine dans un modèle primaire de culture de cellules murines de matière blanche du système nerveux central (SNC) (13) en utilisant le substrat FAO palmitate XF – albumine sérique bovine (BSA) sur un analyseur Seahorse (Seahorse Bioscience). Ce test mesure la FAO en utilisant le taux de consommation d'oxygène (OCR) comme lecture, nous permettant ainsi d'évaluer si une molécule est capable d'inhiber la FAO. Des cellules dérivées de la moelle épinière murine ont été cultivées pendant 8 jours in vitro avant d'être dosées en présence de 0,5 mM de carnitine et de 3M-4-TMAB et 4-TMAP, individuellement ou en combinaison, à 2 mM pendant 24 heures. La FAO a été significativement inhibée par le 3M-4-TMAB seul (réduit de 12% sur quatre répétitions biologiques), par le 4-TMAP (réduction de 14%) ou par un mélange équimolaire de 3M-4-TMAB / 4-TMAP (17% réduction (Fig. 6). L'inhibition observée est comparable à celle de l'étomoxir (réduction de 25%), un inhibiteur irréversible de la FAO. De plus, les tests de 3M-4-TMAB et 4-TMAP en combinaison à 20 μM, en l'absence de supplémentation en carnitine dans les milieux de culture et de dosage, ont indiqué que 3M-4-TMAB et 4-TMAP, à des concentrations similaires à celles trouvées dans Le cerveau murin pourrait réduire considérablement la FAO dans les globules blancs (Fig. S8).

Fig.1. 6 L'OCR a été utilisé comme indicateur FAO en présence de 3M-4-TMAB et 4-TMAP.

L'oxydation du palmitate est impliquée de manière significative dans les cultures primaires de myélinisation du SNC du murin en présence de carnitine et de 3M-4-TMAB, 4-TMAP ou d'une combinaison de 3M-4-TMAB et 4-TMAP aux taux indiqués. L'étomoxir, un inhibiteur irréversible de la FAO, a été utilisé comme témoin. Les valeurs OCR indiquées sont relatives à la BSA et à la condition du palmitate. Chaque symbole représente la valeur moyenne relative d'une expérience (n = 4 expériences indépendantes). Les précurseurs neuronaux utilisés pour générer un modèle de substance blanche du SNC ont été obtenus en regroupant les cellules dissociées de la moelle épinière de tous les embryons d'une seule souris femelle gravide. Un échantillon t Le test a été utilisé pour tester la signification statistique par rapport à la valeur relative 1. P des valeurs ≤0,05 ont été considérées comme significatives. *P <0,05 et ****P <0,0001. Les barres représentent la moyenne ± ET.

L'application d'une approche multidisciplinaire et de nouvelles méthodes d'imagerie a été rendue possible par l'élucidation du mimétisme moléculaire comme autre moyen de communication à travers l'axe MGB. La diaphonie microbe-mitochondrie peut être un moyen important de communication entre le microbiome intestinal et l'hôte, et son importance biologique dans les maladies où la dysfonction mitochondriale et le microbiome intestinal sont des facteurs importants sont susceptibles d'être sous-estimés.

DISCUSSION

Les altérations du microbiome intestinal ont été liées à un certain nombre de conditions neurologiques, ce qui signifie que la compréhension des moyens de communication microbienne à travers l'axe MGB revêt une importance croissante. Cette étude identifie deux nouveaux imitateurs de carnitine dérivés du microbiome intestinal qui colocalisent de manière significative avec la carnitine dans la substance blanche du cerveau murin tout en inhibant la fonction de la carnitine dans des modèles in vitro de substance blanche du SNC murin. La FAO fournit jusqu'à 20% des besoins énergétiques oxydatifs du cerveau et est essentielle pour de nombreuses fonctions neurologiques, les cellules souches neurales dépendant in vitro et in vivo de la FAO pour leur survie et leur prolifération (14, 15 déc.). Compte tenu des résultats récents soulignant l'importance fondamentale de la FAO pour la santé du cerveau, l'identification dans le cerveau de composés dérivés du microbiome intestinal qui interviennent dans l'inhibition de la fonction des cellules cérébrales est d'une importance capitale (15 déc., 16).

L'inhibition de la fonction mitochondriale par les antimicrobiens a déjà été signalée, et il existe de plus en plus de preuves pour soutenir l'existence d'une communication microbiome-mitochondries au sein de l'hôte (17). Bien que la carnitine ne soit pas nécessaire pour le trafic des acides gras dans les microbes, elle agit à la fois comme source de nutriments et comme protecteur contre le stress environnemental (18). Le métabolisme de la carnitine par les microbes entériques génère de la triméthylamine N-oxyde (TMAO), dont les taux sériques élevés indiquent un risque de maladie cardiovasculaire (19 déc.). Les bactéries intestinales peuvent prospérer en présence de carnitine, mais LachnospiraceaeProduction de 3M-4-TMAB et 4-TMAP Clostridia XIV en sont membres, sa présence diminuera probablement en raison de sa supériorité sur les bactéries métabolisant la carnitine (19 déc.). Dans de telles conditions de concurrence, nous supposons que des imitations de carnitine telles que 3M-4-TMAB et 4-TMAP peuvent être produites par ces Lachnospiraceae Dans une tentative d'inhiber la fonction ou le métabolisme de la carnitine chez les bactéries concurrentes.

C. clostridioforme et C. symbiosum, 3M-4-TMAB et 4-TMAP, identifiés mal compris. C. clostridioforme est maintenant reconnu comme distinct de C. bolteae et C. hathewayi, deux espèces qui étaient auparavant classées C. clostridioforme (10). C. bolteae prolifération rapide après perturbation du microbiote intestinal humain, probablement en raison de sa capacité à former des endospores et de sa résistance à de multiples antibiotiques, traits également présents dans C. clostridioforme et C. symbiosum (20 mai, 21). C. bolteae présente une capacité marquée à proliférer et à persister dans l'utilisation post-antibiotique de l'intestin humain, en maintenant sa présence pendant 180 jours après le traitement (20 mai). La présence de C. symbiosum et C. clostridioforme dans le microbiome intestinal est associée à une faible diversité microbienne tout en C. symbiosum la présence pourrait encore distinguer les participants obèses des participants maigres (22e). Le lien entre C. symbiosum et le métabolisme est en outre souligné par sa capacité à favoriser un gain de poids robuste chez les souris à croissance retardée, l'une des deux seules bactéries qui ont montré la capacité (23). La question de savoir si 3M-4-TMAB et 4-TMAP pourrait jouer un quelconque rôle dans ces effets métaboliques mérite une étude plus approfondie, mais nous émettons l'hypothèse que, dans des conditions favorables à une colonisation accrue par ces microbes, la production de 3M-4-TMAB et 4-TMAP Dans l'intestin, il est probable qu'il augmente considérablement avec des effets systémiques potentiels.

Alors que le 3M-4-TMAB est une molécule non décrite précédemment dans la littérature, le 4-TMAP a été synthétisé chimiquement comme un analogue du mildronate, un puissant inhibiteur à la fois des enzymes GBB hydroxylase (BBOX1) et carnitine acétyltransférase (CrAT) (24). Ces enzymes participent respectivement à la synthèse de carnitine et au transport des acides gras dans les mitochondries. Le 4-TMAP est lié dans le site actif BBOX1 humain dans une conformation presque identique au mildronate et a une constante de dissociation inférieure (4,1 μM), mais il s'est avéré qu'il avait des inhibiteurs de concentration (IC50) près de trois ordres de grandeur plus élevés que le mildronate (2426). Cela signifie que les inhibiteurs des effets observés ici sont susceptibles d'être médiés par le ciblage d'enzymes liées à la carnitine autres que BBOX1 et CrAT. Le 3M-4-TMAB présente une similitude structurelle marquée avec un certain nombre d'inhibiteurs connus de la fonction carnitine, y compris l'aminocarnitine dérivée du composé fongique éméricidine (27 mars:). L'aminocarnitine inhibe la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1) et CPT2, et le CrAT en tant que groupe hydroxyle essentiel au métabolisme de la carnitine a été remplacé par une autre chaîne latérale non fonctionnelle. L'élimination de ce groupe hydroxyle, qui est également absent dans 3M-4-TMAB et remplacé par un groupe méthyle, nécessitant la réaction d'estérification nécessaire pour lier un acide gras à longue chaîne à la carnitine, inhibant la navette d'acide gras dans les mitochondries pour l'oxydation. Les recherches futures axées sur le rôle des métabolites du microbiome intestinal dans l'inhibition de la fonction mitochondriale à travers un large éventail de tissus et de types de cellules de mammifères pourraient être très informatives. Un tel travail a le potentiel de fournir un aperçu significatif de la façon dont les influences du microbiome intestinal sont hébergées de manière systémique, pas seulement sur l'axe MGB.

Bien qu'il soit difficile à déterminer sans d'autres tests de confirmation détaillés, la présence de 3M-4-TMAB et 4-TMAP dans d'autres maladies est suggérée par les données et la littérature accessibles au public. Molécule de l'exact m / z de 3M-4-TMAB et 4-TMAP (160.133) a été décrit dans la littérature comme un biomarqueur du diabète de type 2 (T2D), une augmentation significative du plasma du cordon pendant la prééclampsie et prédictif d'une néphropathie diabétique chez les patients T1D (2830). Ces maladies ont toutes un dysfonctionnement mitochondrial associé ou une FAO incomplète. La probabilité du biomarqueur m / z 160.133, ce qui est significativement augmenté chez les patients T2D, étant 3M-4-TMAB et 4-TMAP, soutenu par des études distinctes en Europe et en Chine, dans lesquelles les souches productrices de 3M-4-TMAB / 4-TMAP étaient les plus Espèces considérablement enrichies dans le microbiome intestinal T2D (31, 32). C. symbiosum s'est révélé prometteur en tant que biomarqueur pour la détection précoce et non invasive du cancer colorectal, tandis qu'une molécule de m / z 160,1 a été détecté comme l'une des trois molécules corrélées les plus importantes aux régions hypoxiques dans les tumeurs du cancer du sein (33, 34). Les spectres d'ions produits par l'analyse MS / MS du métabolite dans le modèle de cancer du sein correspondent aux spectres de 3M-4-TMAB et 4-TMAP, indiquant qu'ils sont probablement les mêmes et que 3M-4-TMAB / 4 -TAP peut pénétrer dans les tumeurs.

L'interaction entre le microbiome et les mitochondries de l'hôte est probablement beaucoup plus étendue et complexe qu'on ne le sait actuellement, avec de nombreuses maladies de dysfonction mitochondriale corrélées à des changements bien décrits des populations microbiennes dans l'intestin (17, 31, 35). La dysfonction mitochondriale est également courante dans toute la gamme des conditions neurologiques, les cellules neuronales étant fortement tributaires des mitochondries dynamiques pour répondre à leurs besoins énergétiques élevés (16, 36, 37). Un certain nombre de TSA ont été liés à un dysfonctionnement mitochondrial sous-jacent, avec des descriptions dans la littérature décrivant une augmentation des niveaux d'acylcarnitine, une diminution de la génération de cellules souches médiée par la FAO et une amélioration des symptômes médiée par la carnitine (16, 38). Bien que l'importance des altérations du microbiote intestinal dans les TSA reste controversée, les deux souches productrices de 3M-4-TMAB / 4-TMAP identifiées ici ont été décrites en nombre élevé dans l'intestin tout en étant à de faibles niveaux ou complètement absentes chez les témoins. (39). Ces modifications du microbiome se reflètent dans les modèles de TSA murins tels que le modèle d'activation immunitaire maternelle (MIA), avec une augmentation des Lachnospiraceae à nouveau notée (4). Après le traitement du nombre de Lachnospiraceae dans l'intestin du modèle MIA, des améliorations des comportements de communication, stéréotypiques, anxieux et sensorimoteurs ont toutes été notées, ainsi qu'une correction du métabolisme défectueux des acides gras. Ces carences mitochondriales, parallèlement à celles décrites dans d'autres conditions neurologiques telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, signifient que tout rôle potentiel pour l'apport du microbiome dans l'inhibition mitochondriale mérite une étude plus approfondie.

Il s'agit de la première description mécaniste d'une molécule microbienne inhibant la fonction des mitochondries dans les cellules du SNC. Les deux nouvelles molécules produites par le microbiome intestinal décrites ici sont les premières trouvées dans le cerveau murin qui localisent et antagonisent la fonction de la carnitine. Compte tenu de leur puissance aux concentrations physiologiques trouvées dans le cerveau murin, nos résultats indiquent que les conditions neurologiques, où un dysfonctionnement mitochondrial a été décrit et où des perturbations dans le microbiome intestinal sont notées, devraient être observées avec une amplitude accrue du potentiel d'entrée du microbiome.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Travail animal

Les souris mâles C57BL / 6J GF et SPF âgées de sept semaines provenaient de la Gnotobiotic Facility de l'Université de Manchester. Les souris GF et SPF ont été nourries avec le même régime alimentaire granulé qui a été stérilisé par irradiation avec 50 kGy. Le Manchester Gnotobiotic Facility a été créé avec le soutien du Wellcome Trust (097820 / Z / 11 / B) en utilisant des souris fondatrices obtenues auprès du Clean Mouse Facility de l'Université de Berne. Pour la détermination des métabolites bactériens dans des organes autres que le cerveau et pour déterminer les effets d'un traitement antibiotique sur la production de 3M-4-TMAB / 4-TMAP dans l'intestin, des souris C57BL / 6J qui étaient adaptées à l'âge et au sexe à GF les souris provenaient de l'Université de Glasgow. Pour le traitement antibiotique, les souris ont reçu de la gentamicine (1 mg / ml), de la néomycine (1 mg / ml) et de la vancomycine (0,5 mg / ml) dans de l'eau potable distillée stérile pendant 7 jours. Ces procédures ont été approuvées avant leur initiation par les comités d'éthique de l'Université de Manchester et de l'Université de Glasgow et le Royaume-Uni. Home Office sous les licences 70/7815, P64BCA712 et P78DD6240.

Traitement des tissus

Les souris ont été abattues par luxation cervicale et les cerveaux et les deux points ont été immédiatement disséqués. Les colonies ont été coupées sur toute la longueur, les matières fécales ont été retirées et le côlon a été roulé et noyé dans de la carboxyméthylcellulose à 2,5% (CMC) (Sigma-Aldrich). Les cerveaux ont été placés dans des moules avant congélation à l'aide de glace carbonique concassée et d'éthanol. Les testicules, le cœur, les poumons, le foie, les reins, la rate et les ganglions lymphatiques mésentériques ont été prélevés sur une souris C57BL / 6J, incorporés dans du CMC à 2,5% et congelés instantanément dans de la neige carbonique broyée et de l'éthanol. Le sang a été prélevé par ponction cardiaque et repéré sur une lame de verre et laissé sécher à l'air. Les cerveaux et les deux points ont été coupés à l'aide d'un microtome cryostat (Leica) à 10 μm d'épaisseur à -18 ° C, et les coupes ont été montées par décongélation sur des lames enduites d'oxyde d'indium et d'étain pour MALDI-MSI et des lames de verre normales pour DESI-MSI. Des sections consécutives du cerveau et de l'intestin à côté de celles prises pour le MSI ont été utilisées pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine. Toutes les lames ont été stockées à -80 ° C jusqu'à l'analyse.

Application matricielle et analyse MALDI-MSI

Le MALDI a été utilisé pour l'analyse initiale afin d'obtenir une image à haute résolution latérale pour montrer une distribution précise du métabolite dans le cerveau. Une analyse approfondie a été réalisée à l'aide d'une analyse DESI haute résolution pour les expériences MS / MS, montrant que les spectres des métabolites dans le cerveau SPF et les spectres produits par les bactéries sont très similaires. L'augmentation de la résolution de masse est indiquée sur la fig. S9. MSI de cerveaux et de tripes de souris GF et SPF a été réalisée par MALDI-time-of-flight (TOF). Les résultats ont été confirmés par MSI avec un orbitrap DESI pour gagner en précision m / z valeur. Avant l'application de la matrice, la lame a été prélevée à -80 ° C et amenée à température ambiante sous un courant d'air. Une matrice d'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) a été appliquée à une concentration de 5 mg / ml dans 50% d'acétonitrile, 50% d'eau avec 0,1% d'acide trifluoroacétique à l'aide d'un applicateur matriciel automatisé (HTX Technologies) pour huit passages à 75 ° C, pression de gaz de 414 millibars, débit de 80 μl / min et 1100 mm / min. Les expériences MALDI-MSI ont été réalisées sur un instrument rapifleX MALDI-TOF (Bruker Daltonics) avec un laser à faisceau intelligent de 10 kHZ. L'imagerie a été réalisée à une résolution spatiale de 50 μm avec 600 tirs laser par position. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel flexImaging 5.0 et les données ont été normalisées par le nombre total d'ions.

Analyse DESI-MSI

DESI-MSI a été réalisé sur un spectromètre de masse orbitrap (Q Exactive, Thermo Fisher Scientific) équipé d'une source DESI Prosolia 2D automatisée (Prosolia OmniSpray 2D). La source DESI a été modifiée avec les paramètres suivants. La buse de pulvérisation a été placée à 1,5 mm au-dessus de la surface de l'échantillon et à un angle de 75 °. La distance entre le pulvérisateur et l'entrée du spectromètre de masse était de 7 mm avec un angle de collecte de 10 °. Le solvant solvant était du méthanol / eau (95: 5, v / v), délivré à 1,5 ul / min en utilisant une pompe Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) à une tension de pulvérisation de 4,5 kV. L'azote a été utilisé comme gaz de nébulisation à une pression de 7 bars. Le spectromètre de masse exactif Q a été utilisé en utilisant un réglage d'objectif S de 50 V et en utilisant m / z gamme de 65 à 400 en mode d'ionisation positive, avec une résolution spatiale de 100 μm pour les coupes de tissus et 150 μm pour la tache de sang. Pour l'acquisition des spectres MS / MS, un temps d'injection de 300 ms, une cible de contrôle de gain automatique de 5 000 000 et une résolution de masse de 70 000 ont été utilisés. L'analyse MS / MS a été réalisée en utilisant divers paramètres de dissociation de collisions élevées (présentés dans les résultats) et une fenêtre d'isolement de masse de ± 0,3 Da. Les données ont été converties au format imzML à l'aide de la version 1.1.4.5 du convertisseur imzML et les données ont été visualisées à l'aide de MSiReader version 0.09 (40).

Analyse MSI des taches bactériennes

Pour isoler les bactéries productrices du microbiome murin, les excréments ont été isolés de souris C57BL / 6J et étalés sur des plaques de gélose FAB. Single isolated colonies of murine gut microbiome bacteria or type strains were grown overnight in FAB or on FAB agar. Taxonomic assignment for the strains was obtained using the complete 16S rDNA sequence from each strain and the “Identify” function in EzBioCloud (41). The 3M-4-TMAB/4-TMAP–producing strain, designated LM19, was identified as C. symbiosum, being 99.79% similar to the C. symbiosum type strain ATCC14940. The second producing strain, designated LM41, was identified as being 99.5% similar to the C. clostridioforme type strain ATCC25537. Type strains used for MSI were from the National Collection of Type Cultures (United Kingdom). For MSI analysis, single colonies from FAB agar plates were inoculated into 100 μl of PBS to give an optical density at 600 nm of 0.3. Two microliters of each bacterial culture was spotted onto a glass slide and allowed to dry. Slides were stored in a desiccator until DESI-MSI, which was performed using the same DESI-MSI parameters as above with a spatial resolution of 200 μm.

Nuclear magnetic resonance

Samples (15 mg) were dissolved in 700 μl of deuterated water (Sigma-Aldrich) and added to a 7-mm NMR tube. Presaturation proton NMR experiments were performed by irradiating the water peak at 4.88 parts per million (ppm), using 128 scans, 15-Hz spin with a relaxation delay of 3 s. NMR was carried out using a 400-MHz JEOL LA400 FT-NMR spectrometer system equipped with a 40TH5AT/FG probe (JEOL, Tokyo, Japan). The acquisition of the one-dimensional proton spectra (1H NMR) was performed by the presaturation pulse sequence using 128 scans per analysis. Subsequently, two-dimensional COSY NMR spectra were also acquired with 64 scans. Data points were collected into a plot using spectral widths of 3.93 kHz for F1 and F2. The presaturation method was used to suppress the solvent signal during acquisition.

Analysis of correlation of m/z 160.133 with carnitine in the brain

Data were first converted to imzML using flexImaging (Bruker Daltonics version 4.1), and processing was performed using SpectralAnalysis. Peaks were picked from a mean spectrum generated without any preprocessing using gradient peak detection, and a data cube was generated by integrating the area under each peak. All data were then exported into MATLAB (version 2017a and statistics and image processing toolbox, The MathWorks Inc., Natick, MA) for further analysis.

Tissue data were first segmented from background using k-means clustering (k = 2, cosine distance). Following this, the images from m/z 160.01 and 162.01 (carnitine) were extracted and segmented into binary masks of high and low intensity using a k-means clustering (k = 2, Euclidean distance). The overlap of these regions was then calculated as the percentage of pixels in the high-intensity region of the m/z 160.1 image that were also high intensity in the m/z 162.1 image. In addition, Pearson’s correlation coefficient between the two images was calculated for each tissue.

Synthesis of 3M-4-TMAB and 4-TMAP

All amino acid starting materials were from UkrOrgSyntez Ltd. The general procedure of Lukevics was used to prepare the materials (42). The method of Tars was used for purification (24).

4-TMAP (rac-4-(trimethylammonio)pentanoate) methyl-N,N′-diisopropylcarbamimidate (0.500 ml, 2.75 mmol) was added dropwise to a stirred solution of 4-(dimethylamino)pentanoic acid hydrochloride (250 mg, 1.38 mmol) in MeOH (4 ml) at 21°C over a period of 1 min under nitrogen. The resulting solution was stirred at 21°C for 40 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was slurried in water (6 ml) for 1 hour. The precipitated urea was removed by filtration, and the mixture was evaporated to dryness to give a gum. This material was dissolved in water (5 ml) and loaded onto a column packed with 5 ml of Amberlite IRN78 hydroxide form resin, and the column was stoppered for 30 min before being eluted with water. Product-containing fractions were combined and evaporated under reduced pressure, and the resulting residue was evaporated from acetonitrile to give rac-4-(trimethylammonio)pentanoate (204 mg, 1.281 mmol, 93%) as a white solid. 1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 1.23 (d, J = 6.54 Hz, 3H), 1.29 to 1.39 (m, 1H), 1.76 (ddd, J = 6.0, 9.5, 15.5 Hz, 1H), 1.93 (ddd, J = 5.5, 6.45, 15.0 Hz, 1H), 2.1 to 2.18 (m, 1H), 2.98 (s, 9H), and 3.43 (dqd, J = 2.5, 6.5, 10.5 Hz, 1H); 13C NMR (126 MHz, D2O, 27°C) 180.9, 71.0, 50.6, 34.2, 26.4, and 12.7; liquid chromatography (LC)–MS: m/z 160; assay: 79% (w/w) (quantitative NMR).

3M-4-TMAB (rac-3-methyl-4-(trimethylammonio)butanoate) methyl-N,N′-diisopropylcarbamimidate (0.500 ml, 2.75 mmol) was added dropwise to a stirred solution of 4-(dimethylamino)-3-methylbutanoic acid hydrochloride (250 mg, 1.38 mmol) in MeOH (4 ml) at 21°C over a period of 1 min under nitrogen. The resulting solution was stirred at 21°C for 40 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was slurried in water (6 ml) for 1 hour. The precipitated urea was removed by filtration, and the mixture was evaporated to dryness to give a gum. The material was dissolved into water (5 ml) and loaded onto a column packed with 5 ml of Amberlite IRN78 hydroxide form resin, and the column was stoppered for 30 min before being eluted with water. Product-containing fractions were combined and evaporated under reduced pressure, and the resulting residue was evaporated from acetonitrile to give a gum. The material was sonicated in diethyl ether (ca. 4 ml), and the solvent was removed by pipette to leave a waxy solid that was dried under reduced pressure to give rac-3-methyl-4-(trimethylammonio)butanoate (88 mg, 0.553 mmol, 40%) as a waxy gum. 1H NMR (500 MHz, D2O): 1.18 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 2.23 (dd, J = 7.8, 14.5 Hz, 1H), 2.34 (dd, J = 6.5, 14.5 Hz, 1H), 2.41 to 2.51 (m, 1H), 3.18 (s, 9H), 3.29 (dd, J = 6.0, 13.5 Hz, 1H), and 3.37 (dd, J = 3.54, 13.5 Hz, 1H); 13C NMR (126 MHz, D2O, 27°C): 180.17, 72.37, 53.38, 44.39, 26.62, and 20.13; LC-MS: m/z 160; assay: 74% (w/w) (quantitative NMR).

3M-4-TMAB and 4-TMAP quantitation

A stock solution of 3M-4-TMAB and 4-TMAP (AstraZeneca compound management) was prepared daily as needed at a concentration of 1 mg/ml in 50:50 (v/v) methanol/water. The stock solutions (1 mg/ml) were subsequently mixed to form a working solution (0.1 mg/ml), which was then serially diluted to 11 further working solutions with concentrations in the range of 0.00002 to 0.04 mg/ml. Working solutions at 0.00002, 0.00004, 0.0001, 0.0002, 0.0004, and 0.001 mg/ml were spotted (50 nl using a Biospotter, Biofluidix, Freiburg, Germany) onto GF mouse brain tissue and allowed to evaporate. This deposition of standard translated to 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, and 0.05 ng of 3M-4-TMAB/4-TMAP on tissue. DESI-MSI analysis was performed using the same parameters as above. Data visualization and region of interest extraction were performed using SCiLS Lab MVS 2018b (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) software typically using mass selection window of ±0.05 Da. 3M-4-TMAB/4-TMAP was detected as the protonated molecular ion (M+H+) at m/z 160.1. Extracted mean relative abundance was used from each area of interest to construct calibration curves in Microsoft Excel using a linear fit with unknown endogenous concentrations calculated using the equation of a straight line.

Cell culture

CNS myelinating cultures were established as described (13) with minor modifications. Briefly, embryonic day 13 (E13; day of plug E0) mouse spinal cords were isolated and stripped of their meninges and then dissociated into a single-cell suspension using trypsin and trituration. Cells were plated at 60,000 to 75,000 cells per well of a Seahorse XF96 cell culture plate (35-μl volume) pretreated with poly-l-lysine (in boric acid buffer (0.1 mg/ml; pH 8.4)). Cells were plated initially in 12.5% horse serum, which was gradually withdrawn through feeding every second or third day with serum-free differentiation medium (Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (glucose, 4.5 mg/ml), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), biotin (10 ng/ml), 1% N1, 50 nM hydrocortisone, and insulin (10 μg/ml)). Cells were maintained in 5% CO2 at 37°C.

OCR measurements

On day in vitro (DIV) 8 for CNS myelinating cultures, OCR was measured using the XF Cell Mito Stress Test and XF Palmitate-BSA FAO substrate on a Seahorse XF96 analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MD). Twenty-four hours before the assay, cultures were placed in Substrate-Limited Medium (DMEM supplemented with 0.5 mM glucose, 1 mM glutamine, 0.5 mM carnitine, and 1% fetal bovine serum (FBS)). Just before the assay, media were changed to FAO Assay Medium consisting of KHB buffer (111 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, and 1.2 mM NaH2PO4) supplemented with 2.5 mM glucose, 0.5 mM carnitine, and 5 mM Hepes, adjusted to pH 7.4. To stimulate FAO, palmitate-BSA substrate (200 μM) was added to all wells except the BSA control. 4-TMAP and 3M-4-TMAB effects on FAO were measured by supplementation into wells of 2 mM 4-TMAP or 3M-4-TMAB or 1 mM 4-TMAP and 1 mM 3M-4-TMAB in combination for 24 hours before the assay and for the duration of the assay. For examination of the effect of the concentrations of 3M-4-TMAB and 4-TMAP found in the brain on FAO, the experiment was repeated as before but in the absence of carnitine (0.5 mM) supplementation into both Substrate-Limited Medium and FAO Assay Medium, meaning that FBS was the only exogenous source of carnitine during the assay. 4-TMAP or 3M-4-TMAB (20 μM), or a combination of 10 μM 4-TMAP and 10 μM 3M-4-TMAB, was supplemented into media for 24 hours before assay and during the assay. OCR was measured over time in the presence of either high or low concentrations of 3M-4-TMAB and 4-TMAP, and at least three repeated measures per well were recorded. For each well, the measurements were normalized on the total micrograms of proteins determined at the end of the assay with a Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific). The number of replicate wells varied between 5 and 20 per condition. The values of the repeated measurements were averaged, and a mean value was obtained for each individual well. The OCR values per well were further averaged, and a mean value for each condition was obtained. Last, the mean value for each of the conditions was divided by the value obtained for the condition with palmitate and BSA supplementation. These calculations were applied to each of the independent experiments performed, for which the relative OCR values are reported in the figure.

Microbiome analysis of antibiotic-treated mice

For preparation of DNA samples for microbiome sequencing, fecal samples were defrosted to room temperature and the FastDNA Spin Kit for Soil DNA Extraction (MP Biomedicals) was used for DNA extraction; 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing was undertaken at Glasgow Polyomics for analysis of the microbiome. In brief, primers that were specific to the V3 and V4 regions were used to generate 16S amplicons from 12.5 ng of extracted DNA using polymerase chain reaction. The resulting amplicons had dual barcodes and adapters added using the Nextera XT v2 adapter sets (Illumina). The libraries were combined in equimolar ratios and sequenced on a MiSeq (Illumina) instrument using a paired end, 2 × 300–base pair (bp) sequencing run. Samples were sequenced with an average of 50,000 reads.

For data analysis, FastQ files were generated from the sequencing data and quality-filtered using cutadapt (43). Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads with a minimum quality of 25 and a minimum length of 250 bp. Paired-end reads were combined using PANDAseq and collated into a single FASTA file using the Qiime package (44). Further processing and analysis were completed using the Qiime wrapper and software.

Statistical analysis

For analysis of FAO, at least three independent experiments were undertaken, with each biological replicate shown. For each of the conditions tested, the value of OCR was expressed as relative to the BSA and palmitate condition, and the significance of the differences between conditions was assessed with a one-sample t test (relative value = 1, GraphPad Prism 8.1.2). P values ≤0.05 were considered significant for all statistical tests.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/11/eaax6328/DC1

Fig. S1. Mass spectra from MALDI-MSI and DESI-MSI experiments with the average spectra from GF and SPF mouse brains overlaid.

Fig. S2. MALDI-MSI of organs and blood recovered from C57BL/6 wild-type mice indicated that m/z 160.1 was located systemically in all organs tested as well as present in whole blood.

Fig. S3. MALDI-MSI of colon sections from mice treated with antibiotics for 7 days demonstrates that the metabolite at m/z 160.1 is decreased in the colon of antibiotic-treated mice compared to controls.

Fig. S4. MS/MS analysis of the metabolite found in the brain and the metabolite of the same m/z (160.133) produced by C. clostridioforme was undertaken.

Fig. S5. Mass spectra from the MS/MS analysis of the synthesized standard 5-AVAB compared to the endogenous metabolite in the brain at m/z 160.133.

Fig. S6. Overlap of the ion images of m/z 160.1 and m/z 162.1 (carnitine) from SPF and GF mouse brains and abundance of m/z 160.1 from SPF and GF brains and off-tissue negative control area.

Fig. S7. Additional information to fig. S5.

Fig. S8. OCR was used as an indicator of FAO in the presence of 3M-4-TMAB and 4-TMAP at the indicated concentrations and in the absence of carnitine supplementation.

Fig. S9. Average mass spectra from MALDI-MSI and DESI-MSI results showing peaks at m/z 160.133 (3M-4-TMAB/4-TMAP) and m/z 162.112 (carnitine) from GF and SPF mouse brains.

Table S1. Summary of the top correlations with Pearson’s coefficient > 0.5 for m/z 160.1 (3M-4-TMAB/4-TMAP) for the SPF brain tissue sections shown in Fig. 4.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution license, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: Funding: This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC)–CASE studentship part funded by AstraZeneca (to R.B., D.M.W., and R.J.A.G.) and BBSRC grants BB/K008005/1 and BB/P003281/1 (to D.M.W.). E.K.O. was supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale fellowship 104116/Z/14/Z. S.T. was supported by the Cancer Research UK (C596/A17196, award 23982). J.M.E. was funded by the Multiple Sclerosis Society UK (Grant Ref 38). The Manchester Gnotobiotic Facility was established with the support of the Wellcome Trust (097820/Z/11/B). Author contributions: H.H., L.M.M., R.J.A.G., R.B., and D.M.W. planned the studies. H.H., L.M.M., N.S., J.S., R.A.B., V.H.V., M.J.O., S.B., S.L.B., A.D., M.T.K., J.C.K., J.M.E., R.E.-E., and D.M.W. conducted the experiments. H.H., L.M.M., J.J.J.v.d.H., V.H.V., D.W., S.M., E.K.O., A.S.M., C.J.S., S.T., J.B., G.D., J.M.E., R.E.-E., R.J.A.G., R.B., and D.M.W interpreted the studies. H.H., L.M.M., R.J.A.G., R.B., and D.M.W. wrote the first draft of the paper. All authors reviewed, edited, and approved the paper. E.K.O., S.T., J.M.E., R.J.A.G., R.B., and D.M.W. obtained funding. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

La carnitine dérivée du microbiome imite en tant que médiateurs auparavant inconnus de la communication de l'axe intestin-cerveau
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